Aktivitätsabbildung immobilisierter Enzyme
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Aktivitätsabbildung immobilisierter Enzyme
Anbindung von Proteinen an Oberflächen
Für einige grundlegende Untersuchungen aber auch für Anwendungen in Sensoren müssen biochemische Funktionsträger wie Enzyme oder Antikörper bei Erhalt ihrer besonderen Eigenschaften an Oberflächen angebunden (immobilisiert) werden. In vielen Fällen besteht zudem ein Interesse, die Aktivität oder Bindungsereignisse an diesen Proteinen in ein elektrischen oder optisches Signal umzuwandeln. Dafür kommen Signalwandler (Transducer) zum Einsatz
Wir konzentrieren uns auf die Erzeugung elektrischer Signale für den Ablauf katalytischer (enzymatischer) Reaktionen. In diesem Fall ist der Transducer eine Elektrode. Dies kann zum Beispiel passieren, indem Produkte der enzymatischen Reaktion an einer Elektrode oxidiert oder reduziert werden. Damit möglichst viele der durch das Enzym erzeugten Teilchen die Elektrode auch erreichen, müssen die Biomoleküle in dichten Abstand zur Elektrode immobilisiert sein. Die Grenzflächen für Immobilisierung und elektrochemische Umsetzung können identisch (Abbildung 1), ineinander verschränkt (Abbildung 2) oder räumlich getrennt (Abbildung 3) sein.
Abbildung 3: Schematischer Querschnitt einer Oberfläche, bei der Träger- und Transducerfläche räumlich getrennt sind; a) Anordnung in einem Mikrokanal; b) in einem elektrochemischen Rastermikroskop.
Funktionale Kopplung enzymatischer Reaktionen mit Elektroden
Der Elektronentransfer an der Transduceroberfläche kann über die Oxidation eines Reaktionsproduktes der enzymatischen Reaktion (Abbildung 4) oder über die elektrochemische Regenerierung eines Redoxvermittlers (Redoxmediators, Abbildung 5) oder in speziellen Fällen über einen direkten Elektronentransfer zwischen Elektrode und Protein erfolgen (Abbildung 6).
Gestaltung der Grenzflächen
Je nachdem, welche Transducktionsprinzipien genutzt werden sollen, kommen unterschiedliche supramolekulare Grenzflächenarchitekturen in Frage (Abbildungen 7-12).
Reaktivitätsabbildung von immobilisierten Enzymen mit dem elektrochemischen Rastermikroskop
Die Abbildung der Aktivität von lokal immobilisierten Enzymen an Oberflächen kann mit der elektrochemischen Rastermikroskopie (SECM) in unterschiedlichen Varianten erfolgen.
Abbildungen im Substrat-Generator/Spitzen-Kollektor-Modus
In diesem Fall ein vom Enzym gebildetes redoxaktives Produkt an der Mikroelektgrode des SECM oxidiert oder reduziert (Abbildung 13). Der Vorteil der Methode besteht in einer sehr hohen Empfindlichkeit und in der Möglichkeit neben Oxidoreduktasen auch die Aktivität anderer wichtiger Enzyme wie alkalischer Phosphatase oder Galactosidase zu messen. Der Nachteil besteht in der geringen Auflösung der Methode und spezellen Voraussetzungen, um diese Messungen quantitativ zu gestalten.
Beispiel: Abbildung der Aktivität von Galactosidase (Abbildung 14) nutzt den Umstand, dass beim Detektionspotential p-Aminopehnol oxidiert werden kann. Die Ausgangsverbindung aber nicht. Die Abbildung 15 zeigt eine Rasteraufnahme von drei modifizierten Oberflächenbereichen mit einer unterschiedlichen Menge des Enzymes Galactosidase. Eine Kurvenanpassung an eine Schnitlinie in Abbildung 16 kann zur quantitativen Ausbwertung genutzt werden.
Abbildung im Feedback-Modus
In diesem Fall wird die Funktion eines natürlicher Cosubstrat des Enzymes (etwa O2 bei Gluocoseoxidase) durch einen künstlichen Redoxmediator (etwa Ferrocenderivate für Glucoseoxidase) übernommen. An der Mikroelektrode des elektrochemischen Rastermikroskops wir der Mediator (R in Abbildung 17) kontinuierlich zu seiner oxidierten Form umgesetzt. Eine Stromverstärkung tritt auf, wenn der Mediator durch die zu detektierende enzymatische Reaktion an der Oberfläche regeneriert wird, indem der Mediator Elektronen von dem Enzym aufnimmt.
Der Vorteil der Methode besteht in der sehr gut berechenbaren quantitativen Beziehung zwischen dem Strom an der Mikroelektrode und der der Aktivität des immbilisierten Enzyms. Der Nachtei,besteht in der geringeren Empfindlichkeit im Vergleich zum Generator-Kollektor-Modus.
Beispiel: In der schematischen Darstellung der gekoppelten Reaktionen in Abbildung 17 ist erkennbar, dass die Oxidation von Glucose am Enzyme Glucoseoxidase (GOx) nur abläuft, wenn das an der Mikroelektrode oxidierte Ferrocenderivat zur verfügung steht. In der enzymatischen Reaktion wird die ursprüngliche Form des Mediators regeneriert und steht wieder für eine Oxidation an der Mikroelektrode zur Verfügung, wodurch sich der Strom erhöht. In der Beispielmessung in Abbildung 18 und in der Schnittlinie ist erkennbar, dass die Kanten wesentlich schärfer sind (höhere laterale Auflösung) als in den Abbildungen 15 und 16 unter ansosnten etwa vergleichbaren Bedingungen.
Abbildung im Redoxkompetitionsmodus
In Fällen, bei denen das Reaktionsprodukt der enzymatischen Reaktion Wasser, also das Lösungsmittel ist, kann der Generator-Kollektor-Modus nicht eingesetzt werden. In diesen Fällen kann der Kompetionsmodus zur Anwendung kommen.
Beispiel: Das Enzym Meerrettichperoxidase (horse radish peroxidase, HRP) setzt Wasserstoffperoxid H2O2 zu Wasser um. Die Elektronen können von einem künstlichen Elektronendonor (hier Ferrocenmethanol, Fc) geliefert werden (Abbildung 19). Die Aktivität des Enzyms lässt sich entweder im Generator-Kollektor-Modus durch Detektion oxidierten Ferrocenform (Ferrocenium, Fc+) messen (Abbildung 20). Dabei enteht ein Reduktionsstrom an er Mikroelektrode (Auftragung nach unten). Eine andere Variante ist der Einsatz des Redoxkompetionsmodus (Abbildung 21). Hier konkurrieren die enzymmodifizierte Probe und die Mikroelektorde um das Cosubstrat Fc. Je kleiner der Strom an der Mikroelektrode, desto größer ist die Aktivität der Probe und umso mehr Fc wird dort verbraucht. Die Abbildungen 20 und 21 zeigen Annäherungskurven. Das sind Auftragungen des Stroms an der Mikroelektrode gegenüber dem Abstand zwischen Mikroelektrode und Probe. Je steiler die Kurve verläuft, desto besser ist die resultierende Auflösung in zweidimensionalen Abbildungen. Annäherungskurven können auch sehr gut für mechanistische Untersuchungen eingesetzt werden.
Eigene Beiträge zu dem Gebiet
Übersichtsartikel
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